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1 -. Crecí cristales de mi proteína mediante gota colgante y me gustaría mejorar su calidad. Las condiciones de cristalización que utilicé fueron las siguientes:
En la gota: 6 mg/ml de proteína y 12% de sulfato de amonio.
En el pozo: 24 mg/ml de sulfato de amonio.
¿Cómo puedo extrapolar estas condiciones a la técnica de contradifusión?
2 -. ¿Es posible utilizar la GCB para buscar condiciones de cristalización?
3 -. Me pregunto, ¿cómo se puede utilizar la GCB para experimentos en microgravedad?
1 -. Pienso que tienes tu proteína a una concentración de 12mg/ml y entonces, cuando se mezclan volúmenes iguales de proteína y (NH4)2(SO4) se obtiene la concentración de la gota. Si se dibuja la evolución de la gota en el diagrama de fase. La situación inicial en la gota es C0(en rojo). La concentración inicial en el pozo no aparece etiquetada (en azul). La concentración en la gota cambia debido a que evapora. Sin embargo, mientras las moléculas de agua se mueven desde la gota hacia el pozo la concentración cambia a lo largo de la línea de rayas comenzando en el origen de la gráfica y pasando a través de las condiciones iniciales de la gota. Si el sistema de gota-pozo estuviera completamente cerrado, la evaporación de la gota sería consecuencia de la diferencia de presión entre la gota y el pozo. Por tanto, la concentración de proteína máxima alcanzable en la gota Cmax, es el doble de la concentración de proteína inicial. Si obtiene cristales en la gota, la concentración máxima no se alcanzará nunca. También, si obtiene cristales en la gota esto significa que la localización de la supersolubilidad en la curva se encuentra entre C0 and Cmax.
Puede utilizar sus condiciones iniciales de proteína y agente precipitante (aquellas que usó para la gota). En su caso particular, debería llenar el capilar con su proteína tamponada a 12mg/ml. Entonces prepare el gel de agarosa con el mismo tampón. Finalmente, pinche el capilar en el gel y vierta sobre el estrato de gel la disolución de sulfato de amonio al 24%.
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2 -. Si. Estoy trabajando en la optimización de la capacidad de barrido de las técnicas contradifusivas aunque todavía no tengo un protocolo completo. Mi sugerencia, por ahora, es la siguiente:
- Usar capilares de 0.1mm para minimizar el volumen de proteína.
- Seleccionar un sistema de barrido (Hampton screening, etc)
- Colocar cada uno de las mezclas químicas en la GCB.
- Llenas los capilares de 0.1mm con la solución de proteína a una concentración razonable (entre 10 a 20 mg/ml).
- Colocar los capilares en la guía y asegurar que el extremo más bajo está empapado por las mezclas químicas.
- Es importante notar que puede usar la misma mezcla química con seis proteínas distintas (tres si trabaja con dos concentraciones de la misma proteína).
- Si no ocurre nada en dos días, elimine la mezcla química y sustitúyala por la misma a una mayor concentración.
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3 -. La GCB se puede utilizar para experimentos en condiciones de microgravedad como
un reactor pasivo, sin ninguna parte móvil o manipulación de la tripulación.
El método es simple:
Para llevar a cabo experimentos en microgravedad es necesario suministrar los
reactores unas horas antes de la hora de lanzamiento. Denominamos a este tiempo
como tiempo de espera para el lanzamiento. Después del despegue, es necesario un tiempo para alcanzar la órbita alrededor de la tierra y para el caso de la Estación Internacional del espacio ISS, un tiempo para ser ajustado a la ISS y colocado en un sitio específico. Denominado tiempo de espera para alcanzar órbita.
Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, se prepara la GCB y se pinchan los capilares en el gel una profundidad x tal que:
x > (D· t) 1/2
donde D es el coeficiente de difusión del agente precipitante y t el tiempo de espera para el lanzamiento más el tiempo de espera para alcanzar órbita. Como consecuencia, durante los tiempos de espera para lanzamiento y para alcanzar órbita, el agente precipitante difunde en el gel y se impide la convección. Una vez que la GCB está en órbita alrededor de la tierra, el agente precipitante alcanzará la disolución de proteína que llena los capilares y tendrá lugar la cristalización en un ambiente libre de gel, con transporte de masa controlado por difusión.
Debido a las restricciones de volumen y masa en experimentos espaciales, uno de
los mayores inconvenientes de la cristalización de macromoléculas en el espacio es el reducido número de reactores, lo cual impide el barrido de condiciones de cristalización. Si consideramos que es posible colocar 39 GCB (234 capilares) en un volumen de 10x10x10 cm3 con una masa de 1 kilogramo aproximadamente (disoluciones y geles incluidos), la GCB es un dispositivo simple y económico que puede usarse en cristalización espacial.
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